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2024-07-156297 次瀏覽
血管生成實(shí)驗(yàn)怎么做?NEST來膠你!

“1971 年,Judah Folkman 教授提出 “腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管新生” 理論,認(rèn)為新血管的形成對于腫瘤生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。”

腫瘤細(xì)胞需要新生血管來提供營養(yǎng)和氧氣,以維持其持續(xù)生長和擴(kuò)散。研究腫瘤細(xì)胞的血管生成能力和血管侵襲能力對于了解腫瘤生物學(xué)機(jī)制,以及發(fā)展抗腫瘤治療策略具有重要意義。成血管實(shí)驗(yàn)可以模擬腫瘤微環(huán)境,評估腫瘤細(xì)胞及其周圍細(xì)胞對血管生成的影響。


成血管實(shí)驗(yàn)怎樣設(shè)計(jì)?

跪求具體實(shí)驗(yàn) Protocol?

 一文走進(jìn)熱門實(shí)驗(yàn)技術(shù),為發(fā)表高分文獻(xiàn)提供新思路,“膠”你做實(shí)驗(yàn)!


TIPS:

l 在成血管前需要饑餓培養(yǎng)細(xì)胞,以增加細(xì)胞對生長因子和刺激因子的敏感性,促進(jìn)血管生成。常用于成血管研究的細(xì)胞類型有 HUVEC、HMVEC、HMEC-1 等

l 在成血管實(shí)驗(yàn)中通常有對照組與添加促進(jìn)或抑制血管生成的藥物進(jìn)行對比,以研究該藥物對腫瘤細(xì)胞成血管的影響。

l 一般成血管實(shí)驗(yàn)使用的基質(zhì)膠濃度建議至少 10mg/mL,更高濃度的基質(zhì)膠效果會(huì)縮短血管開始形成的時(shí)間,并且血管形成時(shí)間更長,易于確定觀察時(shí)間窗口。



前排插播

前排插播


NEST 的 GelNestTM基質(zhì)膠取自小鼠腫瘤組織,可增強(qiáng)細(xì)胞粘附、分化和增殖。它模擬生理環(huán)境,是組織工程和細(xì)胞培養(yǎng)研究的理想選擇,尤其適用于類器官和干細(xì)胞培養(yǎng)。它還有助于癌癥研究,如侵襲、血管生成和體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)。

成血管專用款基質(zhì)膠濃度在 12-14mg/mL,相比標(biāo)準(zhǔn)款與低因子款更適合用于體外成血管實(shí)驗(yàn)。





材料與方法

材料與方法


Part.01 GelNestTM成血管專用基質(zhì)膠包被

1. 在 96 孔板的底部均勻鋪上 50μL GelNest?基質(zhì)膠原液(推薦 211492,濃度>12mg/mL),添加時(shí)避免氣泡產(chǎn)生。24 孔每孔約加 280μL,其他孔板按培養(yǎng)面積大小增減。(為防止基質(zhì)膠粘附在槍頭內(nèi)壁, 在吸取基質(zhì)膠前可用槍頭吹吸一次 FBS,對槍頭內(nèi)壁進(jìn)行 FBS 潤洗。)

2. 將培養(yǎng)板置于 37℃培養(yǎng)箱 30 至 60 分鐘。若有液體剩余,可用移液槍輕輕吸出。

3. 包被好的培養(yǎng)板請盡快使用。


Part.02 HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)與成血管

1. 將 HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)至 70-80%的匯合度,原代細(xì)胞代數(shù)應(yīng)該在 5 代以內(nèi)。

2. 將完全培養(yǎng)基替換成饑餓細(xì)胞用培養(yǎng)基:含 0.2% FBS(減血清)、2mM L-谷氨酰胺、1mM 丙酮酸鈉、100U/mL 青霉素和 100μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基,饑餓培養(yǎng) 24 小時(shí)。

3. 胰酶消化 HUVEC 細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

4. 將 5x104個(gè) HUVEC 細(xì)胞加入含基質(zhì)膠的 96 孔板的單孔中,每孔體積控制在 200μL。將 96 孔板放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

5. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)預(yù)計(jì)將在 3 至 12 小時(shí)內(nèi)形成。首次實(shí)驗(yàn)請每隔一小時(shí)觀察一次,以防血管結(jié)構(gòu)繼續(xù)分化,錯(cuò)過觀察窗口。 


Part.03 染色與觀察

1. 血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以直接用相差顯微鏡觀察,也可以用以下步驟進(jìn)行熒光染色。

2. 小心去除培養(yǎng)基,避免破壞血管結(jié)構(gòu)。加入200μL HBSS緩沖液潤洗兩次,并除去。

3. 加入1/1000濃度的Calcein AM(綠色)培養(yǎng)基進(jìn)行染色。

4. 使用熒光顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像,并記錄分析血管網(wǎng)絡(luò)的形態(tài)和特征。



實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析



圖 1.HUVEC 細(xì)胞分別在競品和本公司(GelNest Matrix)基質(zhì)膠上培養(yǎng) 9 個(gè)小時(shí)后形成血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果。標(biāo)尺為 300μm。


可觀察到在 GelNestTM 基質(zhì)膠中血管樣網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成良好。



常見問題與解答

常見問題與解答


1.  應(yīng)該采用何種培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠?

建議使用不加雙抗、不加胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠。


2.  如何使鋪膠更均勻?

槍頭要垂直于內(nèi)孔的正上方,防止有基質(zhì)膠流經(jīng)孔壁殘留。

若是孔的底部沒有鋪滿基質(zhì)膠,可以晃動(dòng)一下96孔板,使底部鋪膠均勻。

若還是沒有均勻鋪滿底部,可用槍頭稍微攪動(dòng)一下。


3. HUVEC必須用專用培養(yǎng)基嗎?能不能用普通培養(yǎng)基?

(1) 若使用普通培養(yǎng)基需要添加生長因子,常見的有ECGF/ECGF,ECGF。

(2) 普通培養(yǎng)基+生長因子的方式價(jià)格較貴,建議使用專用ECM內(nèi)皮專用培養(yǎng)基。


4. HUVEC細(xì)胞系換液第二天為何出現(xiàn)空泡化?如何解決空泡化問題?

可能原因:

(1) 培養(yǎng)液的pH值與細(xì)胞正常所需pH值差別太大,細(xì)胞代謝異常導(dǎo)致空泡化;

(2) 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中由于血清濃度不夠、藥物作用、外界刺激等情況,導(dǎo)致細(xì)胞代謝出現(xiàn)問題,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致出現(xiàn)細(xì)胞空泡化的情況。

解決方法:

(1)測定完全培養(yǎng)基的pH,看其酸堿性是否適宜。多數(shù)細(xì)胞適宜的pH范圍為7.2-7.4。

(2)若培養(yǎng)基或血清是已開封且存放了很久,建議使用新鮮的完全培養(yǎng)基給細(xì)胞換液;若都是新開封的,建議使用新批次的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或血清來配制培養(yǎng)液,給細(xì)胞換液并進(jìn)行觀察。


5. HUVEC培養(yǎng)過程中出現(xiàn)聚團(tuán)如何處理?

聚團(tuán)可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)板親水性差或者血清中的促貼壁因子不足。

解決方法:

(1) 培養(yǎng)瓶使用前一天使用明膠包被。

包被方法:以T25瓶為例,取用5mL明膠放入T25瓶中,37℃放置30分鐘以上,將多余的明膠吸出。

(2) 提高培養(yǎng)液中基質(zhì)膠濃度。

(3) 使用ECM內(nèi)皮專用培養(yǎng)基進(jìn)行配置。


6.  如何判斷加入的基質(zhì)膠體積是否合適?

在孔板下方放置一張格子紙(如圖),垂直透過每個(gè)孔觀察:

(1) 如果觀察到的格子比實(shí)際尺寸小,基質(zhì)膠加入的體積過少;

(2) 如果觀察到的格子比實(shí)際尺寸大,基質(zhì)膠加入的體積過多;

(3) 如果觀察到的格子與實(shí)際尺寸一致,基質(zhì)膠加入的體積適合。



7.  如何解決成管實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞不能形成連續(xù)的網(wǎng)格的問題?

建議使用3-5代狀態(tài)較好且融合度70%-80%的HUVEC細(xì)胞進(jìn)行成管試驗(yàn),此時(shí)的細(xì)胞成管能力較強(qiáng)。

在顯微鏡下邊觀察邊使用胰酶消化細(xì)胞,當(dāng)細(xì)胞變圓時(shí)及時(shí)終止消化過程。消化過度會(huì)影響成管效果。

盡可能保證細(xì)胞數(shù)量約為3萬個(gè)/孔,細(xì)胞數(shù)量過少會(huì)使細(xì)胞無法形成連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)。

選擇低生長因子基質(zhì)膠進(jìn)行成管實(shí)驗(yàn)時(shí),可考慮在培養(yǎng)基中添加生長因子,刺激細(xì)胞形成網(wǎng)絡(luò)狀。


8.  細(xì)胞鋪板數(shù)量如何確定?

由于計(jì)數(shù)方式的差異可能導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量的差異,可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測試合適的細(xì)胞數(shù)鋪板,適宜的細(xì)胞數(shù)量如下圖:



9. 成管實(shí)驗(yàn)需要幾個(gè)小時(shí)?小管形成后為何會(huì)塌縮?

成管時(shí)間與細(xì)胞狀態(tài)密切相關(guān)。細(xì)胞狀態(tài)好時(shí),2-3小時(shí)開始成管,細(xì)胞狀態(tài)較差時(shí),可能18-24h成管。建議第一次實(shí)驗(yàn)時(shí),每隔一個(gè)小時(shí)觀察一次。

成管時(shí)間取決于培養(yǎng)基中血管生成因子的濃度。腫瘤條件培養(yǎng)基中血管生成因子較豐富,容易成管,而基礎(chǔ)培養(yǎng)基所需要的成管時(shí)間較久。

如果使用原代內(nèi)皮細(xì)胞而非永生化細(xì)胞,開始成管的時(shí)間會(huì)延遲數(shù)個(gè)小時(shí)。

小管形成后有塌縮可能是培養(yǎng)時(shí)間過久,內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。


10.  血管形成實(shí)驗(yàn)中使用的凝膠是否需要含酚紅?

對于使用相差顯微鏡,酚紅不會(huì)干擾圖片,并且由于其顏色,處理更容易。

然而,當(dāng)使用熒光顯微鏡時(shí),酚紅可能會(huì)干擾探頭的波長。在這種情況下,最好使用無酚紅凝膠。

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