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        2023-07-312917 次瀏覽
        實(shí)驗 | 細胞增殖檢測-軟瓊脂克隆實(shí)驗

        NEST

        實(shí)驗時(shí)刻

        軟瓊脂克隆實(shí)驗

        軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴(lài)性生長(cháng)實(shí)驗(Anehorage-independentassay),利用軟瓊脂為培養介質(zhì),使細胞在懸浮狀態(tài)下生長(cháng)。

        軟瓊脂克隆形成實(shí)驗方法簡(jiǎn)單,適用于貼壁生長(cháng)的細胞。

        細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數量,主要反映細胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

        Part 01.

        實(shí)驗材料

        細胞培養基、胰蛋白酶、胎牛血清、PBS、瓊脂糖、結晶紫
        細胞培養板、微量離心管(EP管)、移液吸頭、移液槍



        Part 02.

        實(shí)驗操作流程

        1.提前配置1.2%和0.7%瓊脂(Agarose 加蒸餾水配置),高壓滅菌后4攝氏度冰箱保存。鋪板當天微波爐或烘箱加熱融化,置于37攝氏度培養箱中。
        2.鋪下層膠:按1:1比例混勻1.2%Agarose和20%1640,6孔板每孔取2毫升混合液,在室溫條件下等待冷卻凝固。
        3.取對數生長(cháng)期細胞,消化配置成單細胞懸液,計數后將細胞數調整為5*10^4/毫升。
        4.鋪上層膠:按1:1比例使0.7%Agarose和20%1640培養基混勻,取2毫升混合液于EP管中,向管中加入10-20微升細胞懸液,充分混勻后加入已鋪下層膠的6孔板中,待上層瓊脂凝固后,放在37攝氏度培養箱中培養2-3周,每三天向孔板中加入200微升培養基。
        5.顯微鏡下拍照,統計克隆直徑并作圖。



        常見(jiàn)問(wèn)題與解答

        Q:細胞密度為多少合適?

        A:細胞接種密度與最終實(shí)驗結果密切相關(guān),若細胞太多,形成克隆數目太多,處理結果時(shí)數克隆不僅容易出錯,而且圖片很難看(下圖左)。細胞太少,不能形成克隆。如下圖所示:

        上圖我們看到3株癌細胞在6孔板克隆形成圖片,第一個(gè)明顯鋪板細胞太密集,導致難以統計數據;中間那個(gè)正好,最后面那個(gè)細胞數量偏少,且細胞鋪板不均勻。因此,為了獲得美觀(guān)的圖片和準確的數據,第一次實(shí)驗最好設置細胞接種梯度,如500-1000-2000-5000個(gè)/孔挑選出最合適的接種密度。細胞在進(jìn)行克隆形成實(shí)驗時(shí)要求有95%以上的分散度,否則結果的準確度會(huì )受到很大影響;另外注意細胞計數時(shí)建議多計數幾次。

        Q:細胞接種后培養的時(shí)間,如何確定?
        A:通常情況下,單個(gè)細胞在體外增殖6代以上所組成的細胞群稱(chēng)為一個(gè)陽(yáng)性克隆,時(shí)間約為一周;但具體時(shí)間因細胞增殖能力而已異,因此應密切關(guān)注細胞生長(cháng)情況,隔天在顯微鏡下觀(guān)察克隆情況,若單個(gè)克隆細胞數到達50個(gè)左右即可固定細胞。
        Q:細胞鋪板均勻的重要性
        A:若鋪板不均勻,細胞稀的地方形成的克隆少,而密的地方克隆多,一方面影響統計結果,并且拍出的圖片不美觀(guān)。
        Q:細胞未形成克隆的原因?

        A:并非每種細胞都可以形成克隆,克隆形成率與細胞本身增殖能力有關(guān)。還與接種細胞密度,加入培養液的體積、血清濃度有關(guān)。因該實(shí)驗處理時(shí)間較長(cháng),應給細胞多加培養基,如每孔4ml,或者3天更換一次培養基,以供給細胞充足的營(yíng)養。


        Q:計數時(shí)克隆數目較多,有什么快捷辦法?
        A:只要細胞鋪板均勻,我們可以選擇分區計數,取平均數。
        注意事項
        1.細胞一定要吹打分散成單細胞懸液
        2.接種時(shí)細胞密度不可過(guò)高
        3.軟瓊脂與細胞混合時(shí)溫度不可過(guò)高,容易燙傷甚至燙死細胞。
        4.軟瓊脂對熱和酸不穩定,反復加熱容易降解并產(chǎn)生毒性,且容易造成硬度下降,因此需要高壓滅菌后進(jìn)行分裝。
        5.鋪板操作時(shí)速度要快,以免造成局部凝固。


        END

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