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        解決方案 | 293T細胞培養攻略

        細胞攻略

        293T細胞培養

        細胞特點(diǎn)


        01.細胞貼壁能力比較弱

        293T細胞是貼壁細胞,但其貼壁能力比較弱,容易出現明顯的成片脫落現象。比如:運輸低溫及震蕩、在室溫條件下靜置時(shí)間過(guò)長(cháng)、添加的培養基或其他試劑溫度過(guò)低、培養時(shí)細胞密度過(guò)高、細胞聚集時(shí)未吹散、加液吹打時(shí)觸碰了細胞表面等。
        若脫落現象不嚴重應將細胞盡快放回培養基繼續培養,若出現大片脫落的現象需要收集細胞重新消化吹散再接種。
        建議使用經(jīng)TC處理后的培養器皿培養細胞,如NEST細胞培養瓶、NEST細胞工廠(chǎng)等。




        02.細胞本身偏嗜酸性,培養基消耗較快

        293T細胞在略偏酸性的環(huán)境下生長(cháng)狀態(tài)更好,在培養過(guò)程中需要時(shí)刻注意培養基的pH值。
        在細胞密度達到70%以上時(shí),細胞培養基的消耗速度較快,需要時(shí)刻觀(guān)察并及時(shí)換液。


        03.細胞生長(cháng)時(shí)聚集成島

        293T細胞生長(cháng)時(shí)呈島狀聚集生長(cháng),會(huì )逐步向外擴散直到完全融合。


        04.細胞聚集成團之后很難再吹散

        293T細胞傳代過(guò)程中一定要注意吹散細胞,同時(shí)接種的密度不可過(guò)高。密度過(guò)高容易使細胞抱團,導致難以再次吹散,會(huì )在培養器皿中形成類(lèi)似于球狀的聚集體貼壁生長(cháng)。導致即使培養條件合適細胞也難以生長(cháng)。




        細胞培養


        01.細胞凍存

        1. 隨著(zhù)傳代的次數增加,293T細胞會(huì )出現生長(cháng)狀態(tài)下降,出現突變等現象。所以我們需要在細胞購進(jìn)時(shí)就進(jìn)行大量?jì)龃?,以保證實(shí)驗的穩定性和持續性。
        2. 在細胞對數生長(cháng)期進(jìn)行凍存,從而增加細胞復蘇成活率。
        3. 倒去細胞上清液并洗去殘留的培養基。
        4. 加入0.25%的胰酶,消化10-20s后移除。
        5. 鏡下觀(guān)察,當293T細胞變圓且細胞間間隙加大時(shí),加入新鮮培養基吹打混勻。
        6. 細胞計數。
        7. 將細胞離心,1000rpm,2min。
        8.根據計數結果加入細胞凍存液重懸細胞,密度為3×10^6個(gè)/mL。
        9. 將細胞重懸液分裝進(jìn)細胞凍存管,進(jìn)行凍存。
        10. 液氮氣象保存24小時(shí)后建議復蘇一管檢測細胞存活率,細胞狀態(tài)等,若細胞活性合格可長(cháng)期保存,若細胞活性合格率低于80%建議重新凍存。
        注:NEST生物樣本庫解決方案提供細胞凍存全流程產(chǎn)品,如NEST凍存管、NEST凍存液、NEST樣本管理系統、NEST凍存架等。




        02.細胞傳代

        1. 當細胞生長(cháng)至匯合率達到80~90%需要對細胞進(jìn)行傳代操作,以擴大細胞數量,維持細胞良好的生長(cháng)狀態(tài)。
        2. 吸取干凈原有培養基,加入3-4mL常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20秒后舍棄PBS。
        3. 加入適量胰酶,輕輕晃動(dòng)細胞培養瓶使胰酶與細胞充分混勻,徹底消化細胞。
        4. 當細胞間隙變大,但并未完全脫落時(shí)在細胞培養瓶中加入培養基,終止消化?;靹蚣毎?,900rpm離心3-5分鐘后舍棄上清液。
        5. 加入新的培養基重選細胞并均勻分到新的細胞培養瓶中,靜置培養。
        6. 傳代完成24小時(shí)后建議觀(guān)察細胞并換液,以去除死亡細胞。 
        注:NEST細胞培養瓶規格齊全,表面經(jīng)過(guò)TC處理,細胞貼壁效果極佳。同時(shí)NEST已推出新品細胞培養基及細胞鹽溶液(PBS),助力細胞培養。



        03.細胞復蘇

        1. 當細胞傳代次數過(guò)多(超過(guò)50代),細胞狀態(tài)變差時(shí)或細胞出現污染事故時(shí),需要丟棄原有細胞并對一開(kāi)始凍存的細胞進(jìn)行復蘇。
        2. 打開(kāi)水浴鍋,設置溫度為40℃。
        3. 查看NEST樣本管理系統的記錄,根據記錄從液氮氣象中取出凍存的細胞,迅速丟入水浴鍋中并快速晃動(dòng),在1~2 min內使細胞溶液完全溶解。
        4. 加入培養基中并混勻后轉入細胞培養瓶。
        5. 放回37攝氏度、3%二氧化碳和95%相對濕度的培養箱中培養。
        6. 第二天觀(guān)察細胞存活率。倒掉舊的培養基,加入新鮮培養基。注:可使用耐思新推出細胞復蘇儀替代原始細胞復蘇過(guò)程,細胞復蘇時(shí)間短,細胞存活率高。




        Q&A


        01.細胞密度如何計算

        常用的細胞密度指細胞相對于最大生長(cháng)密度的比值,貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養容器底面積百分比表示,即顯微鏡下觀(guān)察培養容器底部,有細胞的區域占總區域的百分比值。
        這種計算方式優(yōu)點(diǎn)是直觀(guān)簡(jiǎn)便,但受限于單個(gè)細胞在不同的生長(cháng)密度時(shí)所占用的培養面積不同,導致計算并不嚴謹。


        02.培養過(guò)程中細胞碎片較多

        • 細胞內的黑色顆粒是細胞外分泌泡以及細胞器的折光,這個(gè)屬于細胞自身特性,無(wú)法清除也無(wú)法改變。而細胞對培養環(huán)境不適應、缺乏營(yíng)養、滲透壓有異常等均可能導致細胞內顆粒增加,建議適當改變培養條件。
        • 細胞外的黑色顆粒為細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,需要先舍棄原有培養基后用PBS潤洗清除細胞碎片,加入新的培養基后繼續培養。
          如果洗無(wú)法除細胞碎片,胞密度處在70-80%左右時(shí)消化處理細胞,終止消化之后勻細胞,收集細胞懸液在900-1000rpm條件下離心3分鐘,舍棄上清液。重懸細離心→再重懸后將細胞懸液接種到新的培養瓶。
          第二次PBS重懸是為了去除碎片,如果碎片很多,建議用PBS多次潤洗細胞。


        03.細胞出現聚團現象

        • 細胞傳代過(guò)程中需要盡可能地吹散細胞,并在顯微鏡下確認細胞基本分散后再把細胞接種到培養瓶中。
        • 優(yōu)質(zhì)的培養體系能有效避免細胞吹散后在貼壁時(shí)再聚團的現象, 也可以減輕細胞聚團后無(wú)法重新攤開(kāi)生長(cháng)的癥狀。
        • 培養過(guò)程中輕微聚團可以稍微延長(cháng)消化時(shí)間,讓大團細胞塊下沉后吸取上層的分散細胞進(jìn)行傳代。若聚團過(guò)于嚴重建議重新培養或者更換培養體系。



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